细胞培养基本技术概述

细胞培养基本技术概述

无菌操作基本技术
1. 实验进行前，无菌室及无菌操作台(laminar flow) 以紫外灯照射30-60 分钟灭菌，以70 %
ethanol 擦拭无菌操作抬面，并开启无菌操作台风扇运转10 分钟后，才开始实验操作。每
次操作只处理一株细胞株，且即使培养基相同亦不共享培养基，以避免失误混淆或细胞间
污染。实验完毕后，将实验物品带出工作台，以70 % ethanol 擦拭无菌操作抬面。操作间
隔应让无菌操作台运转10 分钟以上后，再进行下一个细胞株之操作。
2. 无菌操作工作区域应保持清洁及宽敞，必要物品，例如试管架、吸管吸取器或吸管盒等可
以暂时放置，其它实验用品用完即应移出，以利于气流之流通。实验用品以70 % ethanol 擦
拭后才带入无菌操作台内。实验操作应在抬面之中央无菌区域，勿在边缘之非无菌区域操
作。
3. 小心取用无菌之实验物品，避免造成污染。勿碰触吸管尖头部或是容器瓶口，亦不要在打
开之容器正上方操作实验。容器打开后，以手夹住瓶盖并握住瓶身，倾斜约45° 角取用，
尽量勿将瓶盖盖口朝上放置桌面。
4. 工作人员应注意自身之安全，须穿戴实验衣及手套后才进行实验。对于来自人类或是病毒
感染之细胞株应特别小心操作，并选择适当等级之无菌操作台(至少Class II)。操作过程
中，应避免引起aerosol 之产生，小心****，例如DMSO 及TPA 等，并避免尖锐
针头之伤害等。
5. 定期检测下列项目：
5.1. CO2 钢瓶之CO2 压力
5.2. CO2 培养箱之CO2 浓度、温度、及水盘是否有污染(水盘的水用无菌水，每周更换)。
5.3. 无菌操作台内之airflow 压力，定期更换紫外线灯管及HEPA 过滤膜，预滤网(300
小时/预滤网，3000 小时/HEPA)。
6. 水槽可添加消毒剂(Zephrin 1:750)，定期更换水槽的水。
一、技术信息：细胞和培养液
贮存要求：
细胞：
货一到，即刻做好培养前准备，如开好水浴，保持37℃，再从干冰中取出细胞株，放入水浴中，不停的摇动直到细胞株*解冻。在无菌的工作台里，把解冻好的细胞株用洒精棉球擦冻存管的外壳，预防操作污染。然后把细胞株和自带液体，平均移到两瓶装有15ml—20ml的培养基的培养瓶里面（不需要做细胞株离心，这种损害远比二甲基亚砜更大）。
注意：整个操作流程均遵守无菌操作。
培养液：
把Clonetics细胞培养液贮藏在4℃的冰箱中。使用培养液时，需在无菌的条件下，取出您需要的量，然后把瓶子放回冰箱中。在使用前，务必使培养液恢复室温。
补充物和试剂
如果您计划在三天内次培养，贮存所有的生长补充物——HEPES缓冲盐溶液和4℃下的*中性溶液。Trypsin/EDTA溶液在4℃下贮藏寿命有限。货一到，如果Trypsin/EDTA溶液解冻，立刻分成部分并再次使之冷冻到-20℃；如果Trypsin/EDTA溶液冻结，贮藏在-20℃条件下。如果您不打算在三天内进行细胞培养，把所有的生长补充物和次培养试剂贮藏在-20℃的冰柜中。
Clonetics细胞的安全预防
•为预防污染，在处理来自人体的细胞产品时请遵照来自J.的组织培养方法——“Guidelines to Avoid Personnel Contamination By Infective Agents in Research Laboratories That Use Human Tissues”——概括的所有程序。
•用这些材料时，务必戴上手套和安全镜。用冷冻细胞时，要小心操作；快速的温度变化可能会导致液氮的飞溅。
•在进行操作以前，要对手进行*地清洗。
•在细胞或试剂操作的区域，不要吸烟，吃饭，喝酒。
•决不能用嘴吹移液管。
•来自人体和动物的产品都有潜在的生物危险性。尽管人体细胞系在PCR检测中对HIV-1、乙肝和丙肝为阴性，还是有必要采取适当的预防措施以避免疏忽的暴露。
准备培养液
在无菌条件下按以下步骤操作
对一瓶*是补充液的培养液，操作如下：
1． 如需要，加BBE或BPE于500ml的基本培养液中。
a. 把BBE或BPE补充物从培养瓶中分离
b. 用乙醇或异丙醇清洗小瓶和培养瓶
c. 用移液管把瓶中所有的内容物（大约2ml）放入培养基中。用培养基冲洗装BBE的小瓶并用移液管把培养基移回到500ml的瓶中。
d. 盖上盖子，轻轻地旋转培养液几次使之混合。
e. 记上BBE或BPE加入到培养液时的日期。
对BulletKits®，遵循以下步骤：
1. 用乙醇或异丙醇清洗SingleQuots®冷冻管外表面和基本培养瓶。
2. 无菌条件下打开冷冻管，用移液管把冷冻管中所有的液体移入到基本培养液中。
3. 用培养液清洗冷冻管。冷冻管中的液体不可能*移入到培养液中。小的损失，即使达到10%不会影响补充培养液的细胞生长特性。
4. 把试剂盒提供的标签转移到装有补充液的基本培养瓶上。用它记录日期和每次加入的补充物的量。我们建议您把*标签贴在基本培养液标签上，这样可避免双倍的添加和混淆。
5. 根据贮藏寿命在标签上写上有效期。*重新组装的BulletKits有效期30天。这种补充培养液现在被用作生长培养液。
开始之前
在你准备培养液和细胞以前，请遵循以下步骤：
1． 预备一个无菌的环境
无菌的环境包括*，前面有个敞开的入口和透过性流线式通口或一个等同的装置。
2． 决定所需培养液的量
参看一般塑料器皿的生长面积表以此来决定要用的培养液的量。
3.需用的无菌仪器和试管
•无菌可随意使用的血清学上使用的移液管
•微型移液管和无菌移液尖
•可调节的多孔道的移液管和可重复使用的移液管
•盛装多孔道移液管的无菌贮藏盒
•15ml无菌离心管
•细胞培养瓶
•多孔平底的组织培养板
•血球计或细胞计数器
4.其他需求的试剂：
•70%酒精（乙醇或异丙醇）
•生长培养液（特定细胞株）
•保护性手套和外罩
•台盼蓝
5． 为zui初的实验草案计划和准备
要依据伴随有产品的分析证书上标明的细胞数。
6． 要核对培养箱中的湿度刻度。培养箱应保持潮湿和37℃，装有5%CO2和95%空气。
培养已定的贴壁细胞株
这些说明不适用于RHNP,hNHEPS®,rtNHEPS,smNHEPSTM,NHDC,HPBMC和生血的干细胞。
1．计算要用的器皿的个数。参看分析证书，决定你试管中需要的确切的细胞数。参看6.3页的“普通塑料器皿的生长面积”表有助于调节这种计数。
如果种植密度为2500细胞/cm2、3500细胞/cm2或5000细胞/cm2
请遵循以下计数法来算出所需器皿的个数。
(可装的细胞数х百分存活率)/建议的细胞密度=能种植的zui多细胞数/cm2
能种植的zui多细胞数/平方厘米/试管有效生长面积=需准备的zui多试管数
用多个T-25试管而不用一个等量的相对大的试管的优点，就是减少了一下子失去大量细胞的冒险性。也就是说，如果一个T-25试管*化有问题，还有其他的T-25试管可用。
2． 试剂瓶上贴上标签，标明代数、细胞类型、分开的数目和日期。
3． 在无菌条件下，小心地打开装有生长培养液的补充培养瓶，按每5cm2表面加1升生长培养液的标准，无菌的把培养液转移到新的培养液中。
4． 请拧松试剂盖。如果用的不是可松动的瓶盖，拧紧瓶盖，然后拧松到1/2圈。让培养试管在37℃潮湿和装有5%CO2的培养箱中温育平衡至少30分钟。
解冻贴壁细胞株
无菌条件下把定量的培养液加入试剂瓶中，并放入5%CO2和37℃的培养箱中平衡30分钟。
1. 解冻以前准备一个小型移液管。
2. 从仓库中取出冷冻细胞管。在打开以前，用乙醇或异丙醇清洗冷冻管。无菌条件下，暂时旋转瓶帽1/4圈以减轻内部压力，然后再旋紧。不要一下子打开冷冻瓶。
3. 拿着冷冻管，把冷冻管的3/4底部浸泡入37的水浴中并轻轻旋转1-2分钟直到内容物解冻为止。凑近看冷冻管，当zui后一条冰块融化时，移走它。禁止把冷冻管*浸泡于水中。解冻细胞超过3分钟会达不到理想的效果。
4. 迅速移出冷冻管，擦干并把它转移到无菌环境下，此时平衡后的培养液正有待于细胞的移入。用70%的乙醇清洗冷冻管，然后擦干并移走多余的。
5. 注意解冻管中细胞的颜色。理想情况下，解冻管中细胞的颜色是粉红的。如果颜色不是粉红的，种植细胞并记下颜色。如果培养不成功，询问一下您的技术专家，并把细胞的真实颜色告诉专家。
注示：
——如果每个冷冻管要解冻，一次解冻一个，并且使其他冷冻管放在液氮中。
——冷冻保存的细胞很娇嫩。解冻后以zui少的抚摸尽可能快的速度把细胞放回培养液中。
——当处理冷冻细胞时，戴上眼罩。快速的温度变化可能导致液氮的飞溅。
——从防冷冻的混合液中移走细胞，离心过滤法不宜采用。离心过滤的损害性比DMSO残留在培养液中更大。
——直接在玻璃滑板、格子板或多空离心板上解冻细胞是不合适的。如果zui初从冷冻保存中移植入T-25试管中，*的性能才能体现。如果更深一步了解，请遵循上述提供的细胞培养的方法。
种植贴壁细胞株
1． 打开瓶盖，小心不要用手指碰到内部的危险物。
2． 用1000μl微型移液管定到800μl，把管尖插入冷冻管中，用移液管轻缓而平稳地上下移液不超过5次以此来使细胞悬浮。决不要使细胞悬浮太快，把管尖插入到近底部以免产生气泡。
3． 把细胞等量的分送到预备好的试剂瓶中。如果准备的是四个T-25，把微型移液管调到250μl进行分送；如果准备的是八个T-25试剂瓶，把微型移液管调到125μl进行分送。
4． 盖上瓶塞，轻摇小管使细胞在管中均匀分布。如果有必要，拧松瓶塞允许气体交换。
5． 把培养管放回5%的37℃的培养箱中。平放在架子上，使细胞能zui大程度地着壁。细胞将附着在试剂瓶表面的底部生长。
种植以后
细胞不能承受快速的温度变化，也不能在营养缺乏的培养基上生长。用已经温化的新鲜生长培养液培养细胞将会防止潜在的问题（切记：仅温化所需量的培养液）检查和喂养下表中的细胞，即使在周末和假期。
1． 种植细胞的当天，换一下生长培养液（移走残留物和不贴壁细胞）然后当每天检查它们时，每隔一天换一次培养液。
2． 成功的重新利用培养液将会展现以下特点：
a.细胞质是清晰的，无颗粒的
b.两天后呈现出大量有丝分裂的形体。
3． 当细胞变得更加融合时，用更多培养液喂细胞，用下表作为参考：
如果细胞是 然后喂它们
<25%融合 1ml/5cm2
25-45%融合 1.5ml/5cm2
>45%融合 2ml/5cm2
4.在达到70-90%融合以前，继续喂养，如果特殊细胞株允许过度融合（比如说上皮细胞）并且在融合状态下超过两天，那么它们很难承受不可逆的接触抑制，可以从烧杯中分离开来，很难使其受*的作用。

增殖贴壁细胞株
1． 在货运的过程中仔细检查一下培养基有没有短缺的信号。检查相对细胞密度，估计百分融合度。根据收条，培养基应该是30-100%的融合。有一些细胞分离是正常的。如果细胞看起来严重请立刻询问您的技术专家。
2． 用70%的乙醇或异丙醇清洗细胞培养试剂瓶或多孔板的外表面。
3． 把密封试剂瓶或多孔板放入37℃、5%CO2的环境下3-4个小时，使之达到适宜的温度。
4． 在无菌培养箱中把适量的生长培养液温育到37℃。温育整个瓶子能缩短培养液的寿命。不要在流动的热水下或难以控制的热源下温育培养基。决不要用微波传送热。
5． 无菌条件下，小心打开细胞培养试剂瓶或多孔板，移走培养液，换上温暖新鲜的培养液。无菌条件下移走瓶颈或瓶盖上的培养液，以免有细菌污染。
6． 如果试剂瓶上装的是不透气的瓶盖，拧松瓶盖，把试剂瓶放回到5%CO2和37℃湿润的培养箱中，至少培养24小时。
次培养贴壁细胞株
次培养试剂的贮存信息
1． 次培养试剂经过过滤消毒，在从Cambrex发送中心发送以前，一直贮存在-20℃的条件下。
2． 在运输过程中，次培养试剂可能会解冻。它们可能需要再次冷冻。
3． 再次解冻和冷冻后，次培养试剂贮存在-20℃的条件下可长达一年。
4． 为保持Trypsin/EDTA冷冻后新鲜性和活性，你可以把它分成部分装入无菌离心管中再次冷冻到-20℃。Trypsin/EDTA可冷冻贮存一年。
5． HEPES-BSS和*中性溶液贮存在4℃条件下，保质期一个月。
96孔培养板上的次培养
概要
正常人体细胞培养瓶要经过*化作用和随后的*抑制剂的处理。细胞离心后，悬浮在生长培养液中，同时可记数。既定数目的细胞移入96孔无菌组织培养板上。培养板在37℃、5%CO2和湿润的培养箱中培养1-3天，这样细胞就可以贴壁和生长。种植密度根据你的实验要求而定。多孔板上的细胞密度为10,000细胞/cm2理想。如要了解你正用的细胞株的特别信息，请参看细胞培养说明单。
冷冻保存的方法
冷冻保存可能会损害细胞的质量和性能。细胞经过冷冻保存后，其性能不能保证。这些说明不适用于CloneticsTM肝细胞或神经始祖细胞。
方法：
1． 用分辨率为0.2的微量过滤细胞培养器无菌过滤冷冻培养液。
2． 把细胞收集起来并旋转倒置。
3． 在大约500,000-2,000,000细胞/ml的冷冻液中再次使细胞悬浮。动作要迅速。一旦置于DMSO下，细胞就会变得脆弱。
4． 用移液管等分成1ml装入到冷冻管或瓶中。
5． 用Styrofoam®或丙醇冷冻罐使等分部分隔离。
6． 在-70℃条件下贮存细胞一夜。
7． 在12-24小时内，可放在LN2（-200℃）中长期保存。在-70℃下延长保存会损害细胞。
以下是冷冻保存液：
通道细胞培养液的选择
通道细胞培养液都是非血清培养液，适合于通道细胞的增殖。基本培养基的每一种成分和每一种生长补充物都有Cambrex及其小组经过认真地测定，使之zui适于生长。考虑到不同的性能要求和制作的灵活性，目前Cambrex提供了两种适合于通道细胞生长的培养液。选择培养基时，先看看特定的培养液说明书或者请教一下你的技术专家。
以下是培养液产品：
内皮细胞培养液的选择
内皮细胞培养液都是低血清培养液，适合于内皮细胞的增殖。基本培养基的每一种成分和每一种生长补充物都有Cambrex及其小组经过认真地测定，使之zui适于生长。考虑到不同的性能要求和制作的灵活性，目前Cambrex提供了四种适合于内皮细胞生长的CloneticsTM培养液。选择培养基时，先看看特定的培养液说明书或者请教一下你的技术专家。
以下是培养液产品：
纤维原细胞培养液的选择
纤维原细胞培养液适合于纤维原细胞的增殖。基本培养基的每一种成分和每一种生长补充物都有Cambrex及其小组经过认真地测定，使之zui适于生长。考虑到不同的性能要求和制作的灵活性，目前Cambrex提供了两种适合于纤维原细胞生长的培养液。选择培养基时，先看看特定的培养液说明书或者请教一下你的技术专家。
以下是培养液产品：
以下是肝细胞培养液产品：
角化细胞培养液的选择
角化细胞培养液适合于角化细胞的增殖。基本培养基的每一种成分和每一种生长补充物都有Cambrex及其小组经过认真地测定，使之zui适于生长。考虑到不同的性能要求和制作的灵活性，目前Cambrex提供了三种适合于角化细胞生长的培养液。选择培养基时，先看看特定的培养液说明书或者请教一下你的技术专家。
以下是培养液产品：
以下是淋巴细胞生长培养液（非血清）产品：
黑素细胞培养液的选择
黑素细胞培养液适合于黑素细胞的增殖。基本培养基的每一种成分和每一种生长补充物都有Cambrex及其小组经过认真地测定，使之zui适于生长。考虑到不同的性能要求和制作的灵活性，目前Cambrex提供了两种适合于黑素细胞生长的培养液。选择培养基时，先看看特定的培养液说明书或者请教一下你的技术专家。
以下是培养液产品：
以下是神经细胞培养液（低血清）产品：
以下是前列腺上皮细胞培养液（非血清）产品：
以下是肾细胞培养液（低血清）产品：
以下是骨骼细胞培养液产品：
以下是骨骼肌细胞培养液（非血清）产品：
平滑肌细胞培养液的选择
平滑肌细胞培养液适合于平滑肌细胞的增殖。基本培养基的每一种成分和每一种生长补充物都有Cambrex及其小组经过认真地测定，使之zui适于生长。考虑到不同的性能要求和制作的灵活性，目前Cambrex提供了两种适合于平滑肌细胞生长的培养液。选择培养基时，先看看特定的培养液说明书或者请教一下你的技术专家。
以下是培养液产品：
以下是基质细胞培养液（低血清）产品：
以下方法是针对25cm2试管来说的。对大小不同的试管，可相应得调节溶液的体积。
准备
准备次培养的*个试剂瓶
1． 当细胞达到70-90%融合并且在整个试剂瓶中包含大量有丝分裂形体后，次培养它们。
2． 次培养25cm2细胞
a.解冻2ml*/EDTA溶液并且使之达到室温
b.使5ml的HEPES Buffeced Saline Solution(HEPES-BSS)溶液达到室温
c.使4ml*中性溶液(TNS)达到室温。
3． 从4℃的冰柜中取出生长培养液，使之达到室温。
4． 准备新的培养器皿
a) 准备5-10T-25试剂瓶。所需试剂瓶的数目依据混合度和总产量而定。用大的试剂瓶可节省塑料器皿和接下来花在次培养上的时间。小的试剂瓶可以减少失去你培养液中有效成分的机率。
b) 像以前一样，在每个试剂瓶上贴上标签，标签上标明代数、菌株数、细胞类型和日期。
c) 在无菌环境下，小心打开瓶口，按每5cm²表面加1ml生长培养液的标准，把生长培养液转移到新的培养器皿中。
d) 如果没用可排气的瓶盖，拧松瓶盖。把新的培养器皿放到盛有5%CO237℃潮湿培养箱中，并使器皿置于此环境下至少30分钟。
一次性培养一个试剂瓶，遵循化草案（在这个过程中以后解释），所有试剂瓶中的细胞都应在*个试剂瓶后被次培养。这种草案依据合适的细胞计数，细胞存活率和细胞密度而定。
在无菌环境下
（以T-25试剂瓶为例，对其它试剂瓶增加其相应溶液体积就行）
1. 从一个培养器皿中吸收培养液
2. 用5ml室温下的HEPES-BSS溶液漂洗细胞。不要忘记这一步，培养液中包含有能中和*的复杂蛋白质。
3. 从试剂瓶中吸入HEPES-BSS溶液。
4. 用2ml*/EDTA溶液覆盖细胞。
5. 拧紧瓶盖，并且在显微镜下观察试剂瓶中的细胞。
6. 显微镜下继续检查细胞层。
a. 将近90%的细胞被收集后，停止*作用。
注：收集的细胞呈球形的，有光滑的边缘，并且能折射的或光亮的，如果细胞仍然粘附瓶壁，他们需要更长时间的*化，根据不同的细胞株，整个过程需要花费2-6分钟。
b. 此时，用手背轻敲试剂瓶使大量细胞从培养基表面释放出来，如果仅有一些细胞分离，你的*化不足，等30秒后再次轻敲。如果细胞仍然不分离，此后每等30秒后，再次轻敲。
注：不要剧烈地叩击以期望所有的细胞都从培养基表面脱离。这种行为将会损害细胞。
7. 细胞脱离后，用4ml室温下的*中性溶液中和试剂瓶中的*。如果大量细胞没有在几分钟内分离，*要么没有进行足够的温化或没有分离这些细胞的足够活性，像上述那样收集培养器皿，要么用新鲜温暖的*/EDTA溶液再次*化，要么用*中性溶液漂洗，然后把新鲜温暖的培养液加入到培养器皿中，接着把试剂瓶放回培养箱，直到新鲜的*化作用的试剂可用为止。
8. 快速把分离的细胞转移到15ml无菌离心管中。
9. 用zui后2mlHEPES-BSS溶液漂洗试剂瓶，来收集残余细胞，并把这些漂洗液放入离心管中。
10. 在显微镜下检查一下已经被收获后的试剂瓶，如果试剂瓶中残留的细胞数目不到5%，细胞收获是成功的。
11. 数一下细胞并计算一下每毫升细胞数和整个试剂瓶中的细胞数。
12. 把浮在表面的东西加入到组织培养瓶中，轻轻地混合并把其放入到培养箱中。
你可以用下述步骤次培养细胞，你可以用台盼蓝估计细胞产量和存活力。
按照以下步骤：
1. 用血球计或细胞计数器数细胞，计算细胞总数，记录一下你的细胞数量以备后用。
为了获得zui大的性，悬浮细胞液应包含250.000—1.000.000细胞/毫升。
2. 如果必要，用HEPES-BSS稀释悬浮液而得到需要的细胞数/毫升，再次数一下细胞。
3. 用台盼蓝估计细胞存活力。
4. 用以下等式决定总的细胞存活数。
=总的细胞数*百分存活率
5. 用以下等式决定接种试剂瓶中细胞总数，需要的试剂瓶中的数目依据细胞产量和种植密度而定。大的试剂瓶可节省塑料器皿和接下来次培养的时间。如果污染发生小的试剂瓶可减少失去培养液中有效成分的机率。建议种植密度为2500细胞/cm²，3500/cm²或5000/cm²
6. 用下面等式计算出你要种植的细胞悬浮液的体积。
7. 在每个试剂瓶中贴上标签，标明代时，分开日期、细胞株和日期。
8. 小心打开培养瓶，按每5 cm²表面加1ml生长培养液的标准，把生长培养液加入到新的培养器皿中。
9. 用5ml移液管使稀释细胞混合，确保悬浮液均衡，把上述计算过的悬浮液的体积分发到预备好的次培养试剂瓶中。
10. 分发细胞后，轻轻摇动试剂瓶而促使细胞均衡分布。
11. 如果不用可透气的瓶盖，拧松瓶盖，把新的培养器皿放入盛有5% CO2的37℃的有湿度的培养箱中
要求的材料：
1. 在70%-90%融合下的正常增殖人体细胞用的T-25试剂瓶
2. 96孔平底组织培养板。
3. 盛有5% CO2/95%空气的37℃有湿度的培养箱。
4. 层流板或其他无菌环境。
5. 可调节的多孔道移液管（8或12孔）或重复使用的移液管。
6. 用多孔道移液管使将用的贮存箱无菌。
步骤：
1. 为准备次培养和进行次培养，请遵循以下步骤。
2. 因为细胞数/毫升的计数是每毫升，所以细胞在植入96孔板之前，细胞浓度必须增加4倍，当制作细胞悬浮液时，用生长培养液调整细胞密度。
3. 把稀释后的细胞悬浮液转移到无菌贮藏瓶中。用装有无菌移液尖的多孔（8或12孔）移液管，把250μl的稀释细胞培养液加入到标有96孔平底组织培养板的每一个孔中。每次分发植入细胞时，都要使细胞再次悬浮以确保细胞在瓶中分布均衡，使细胞再次悬浮的办法是用移液管在瓶中上下移动几次。
4. 在37℃/5% CO2的培养箱中，盖上培养板并培养1-3天。（培养期超过三天通常不被采用，因为板孔边缘培养液的蒸发）
注：在生物测定中，在用96孔板培养以前，在显微镜下观察有丝分裂的存在，以确保细胞恢复了活性生长。
提高细胞产量和存活力
几种因素或因素的综合使细胞产量和存活力降低，如果不满意细胞产量或存活力，用以下信息增加日后培养的成功率。
提高细胞产量
如果细胞产量低（少于50%），用下表找到原因和可能的解决办法。运用合适的方法次培养多个试剂瓶。
解冻CD34+和前体细胞的步骤：
1. 温化含有10%FBS或1%BSA的培养液，对单核细胞来说，Dnase也能被加进去。
2. 在37℃水浴中快速解冻冷冻细胞，用70%异丙醇擦洗试管的外部。
3. 无菌条件下把2mlzui大量的细胞悬浮液转移到50ml圆锥形的试管中。对于一百万个细胞或更少用15ml圆锥形小管。
4. 用1ml培养液漂洗小管，当轻轻摇动试管（约1分钟）的过程中，把悬浮液逐滴加入细胞中。
5. 每加入一次培养液，都要轻轻旋转一会儿（约3分钟），慢慢地逐滴加入直到是5ml培养液于细胞中。
6. 每加入一次培养液，都要轻轻旋转一下（约5-10分钟），慢慢地逐滴加入1-2ml培养液使试管充满。
7. 在室温下，以zg的情况使细胞悬浮液离心15分钟。
8. 用移液管小心移去大多数洗液，留下几毫升，这样细胞颗粒不会被干扰，轻轻摇动使培养液的细胞颗粒悬浮。如果你用50ml试管，把细胞转移到15ml圆锥形管中，要用5ml培养液漂洗50ml试管，慢慢地把5ml冲洗培养液加入到细胞悬浮液中，同时轻摇。
9. 慢慢地加入1-2ml体积培养液使试管充满，同时加入以后都要轻摇一下。
10. 室温情况下，离心细胞悬浮液15分钟。
11. 用移液管小心地移走洗液，仅留2ml洗液，轻轻地再次使装在2ml培养液的细胞颗粒悬浮并计数，如果细胞数目低于预计的，在8级更高速度下，离心保留下来的洗液，计数并且在必要的情况下合并。
12. 在37℃和5% CO2下使细胞休息1小时，再次数一下细胞，细胞有待于在培养基中培养。
CloneticsTM培养基系统
培养基为正常人体细胞的特殊类型的*化生长而制作的。可以先买无补充物的基本培养基，再加入补充的生长培养基，或方便地购买包装好的Bulletkits®试剂，它能允许用户控制补充液类型和浓度。每种培养基经检验都能支持预定正常人体细胞的生长。每块培养基的性能都经过生化和无菌检验，对于所要的培养基产品，都有分析合格证书。
基本培养基
基本培养基适用于正常人体细胞特别类型培养。基本培养基不包含细胞增殖必要生长因子。生长因子必须被加入以增强效能和细胞增殖。许多Clonetics培养基从Richard Ham实验室中制造出来的。该实验室属于Colorado大学的分子与细胞发育生物学系。新的和改良的人体细胞培养基也是在我们的培养基研制室有规律的制造出来。优化制作使得正常人体细胞株在更广泛的研究成为可能。这几年培养基的发展对你自己研究更有利。
*培养基
*培养基补充有生长培养基，并且包含所有的生长因子和有助于正常人体特殊细胞株增殖的必要补充物。没介定的补充物在可能情况下可以避免，当有必要时可以zui低的标准用，所有生长培养基的基本制作包括有抗菌剂，订购抗菌剂的培养基可作特殊订购。
Bulletkits
Bulletkits提供了培养基的zui后制作程序的灵活性，而是增加了保存期限，每个Bulletkit包含基本培养基和预先测定的单独用的生长因子和抗菌剂，以此来制成你选择的补充生长培养基。
特定培养基
Cambrex的正常培养基制作实验室允许你选择的培养基成分的浓度改变。特定培养基牵涉到库存培养液的再制作，培养液包含氨基酸、维生素、微量矿物、盐类、糖类和对细胞代谢必需的其他相对稳定的生化物质。根据你的要求，特定生长因子和你自己需要的额外成分也能被加入制成培养基。Cambrex也研制出了非血清或低血清的培养基以备你选择的人体细胞株生长。请咨询。
BEGM®Bulletkit®
基本培养基以MCDB-151和LHC-9制作的改动为基础。
支气管上皮细胞的生长的培养液包含抗菌剂SAGMTM Bulletkit
用CCMD-161制作方法，基本培养被研制出来。
小的通道上皮细胞和支气管的上皮细胞的无抗菌剂培养液的生长。
EGMTM和EGM Bulletkit®
基本培养基以有少许改动的MCDB-131的制作为基础；以低血清的环境下制成正常人体内皮细胞。
EGM是补充生长培养液，包括牛脑提取液的粘附部分。
EGM Bulletkit包括有附加成分的基本培养基和分升冷冻包装的生长因子。
zui终血清浓度是2%
EGN可用来培养所有的除微血管、冠状动脉和脐动脉以外的Clonetics内皮细胞。
EGM-MV Bulletkit
适合微血管和冠状动脉内皮细胞
像EGM一样，也是基本培养基
zui终血清浓度为5%
EGM-MV可用来培养除HMVEC-L之外的所有的Clonetics内皮细胞
EGM-2 Bulletkit
提纯后的基本培养基和生长因子
不包含BBE
zui终血清浓度为2%
此EGM能提高细胞的增殖
EGM可用来培养除微血管和冠状动脉之外的所有Clonetics内皮细胞
EGM-I-MV Bulletkit
适合增强肺微血管内皮细胞的生长
不包含BBE
zui终血清浓度增加到5%
EGM-I-MV能用来种植所有的Clonetics内皮细胞
FGM®Bulletkit®
依据MCDB-202的配方设计的基本培养基
FGM是特定的不包含血清的培养基系统
FGM-2 Bulletkit
依据MCDB-202的配方设计的基本培养基
包含FBS的单个成分，zui终血清浓度为2%
KGM®和KGM Bulletkit®
依据有改动的MCDB-153配方设计的基本培养基，适合于在非血清环境下Clonetics正常人体角化细胞的生长。
KGM包括补充培养基和牛垂体提纯物的粘附部分
KGM Bulletkit包括所有补充成分的基本培养基和分开冷冻保存的生长因子
KGM培养所有CloneticsTM角化细胞
BGM-2 Bulletkit®
依据有改动的MCDB-153的配方设计的基本培养基，用来培养正常新生儿的黑素细胞
非血清
牛垂体提取液（BPE），7.5mg/ml
基本钙浓度降到0.5ml
BGM-3 Bulletkit
依据有改动的MCDB-153的配方设计的基本培养基，用来提高新生儿和成人黑素细胞的生长率
zui终血清浓度为0.5‰
zui终基本钙浓度为0.5ml
MGM-3用来培养所有的黑素细胞
SmGM-2 Bulletkit®
依据有改动的MCDB-133的配方设计的基本培养基，适合在低血清下培养平滑肌细胞
SmGM-2 Bulletkit更有利于细胞形态和增殖
*被移走后，所有生长因子re-titered，同时，加入胰岛素
zui终血清浓度为5%
SMGM-2可培养所有平滑肌细胞
SmGM-3 Bulletkit
该培养基在平滑肌细胞分离中选择性更强
降低分化细胞的同时，进一步增强增殖
对基本培养基是一种调节
更特定的培养基，zui终血清浓度为0.5%
FBS:Fetal Bovine Serum,胎牛血清；
Defined FBS：特级胎牛血清，经过40纳米过滤的*胎牛血清。的促细胞生长作用及产品稳定性。内毒素含量<10EU/ml，血红蛋白含量<10mg/dl。
Characterized FBS：优等胎牛血清，经过三次100纳米过滤。内毒素含量<25EU/ml，血红蛋白含量<25mg/dl。
Standard FBS：标准胎牛血清，经三次100纳米过滤的高品质胎牛血清。低内毒素和血红蛋白含量。优良的性能价格比。
Certified New Zealand FBS：新西兰胎牛血清，原料血产于新西兰。由HyClone公司加工生产，*符合HyClone公司质量检测标准。内毒素含量<20EU/ml，血红蛋白含量<25mg/dl。
Charcoal Dextran Treated FBS：活性炭/葡聚糖处理的胎牛血清，经过活性炭/葡聚糖处理，使各种激素含量大大降低。内毒素含量<10EU/ml，血红蛋白含量<20mg/dl。
Dialyzed FBS：透析型胎牛血清，以10000分子量为分离点的过滤系统过滤，使次黄嘌呤和胸腺核苷降低到正常测定方法检测不到的超低含量。内毒素含量<10EU/ml，血红蛋白含量<10mg/dl。
Low IgG FBS：天然低IgG胎牛血清，由天然发生（非经化学方法清除）的低IgG含量血清收集起来统一加工而成。IgG含量低于20mg/ml尤其适合于单克隆抗体的生产。经40纳米过滤。内毒素含量<25EU/ml，血红蛋白含量<25mg/dl。
ES Cell Screened Defined FBS：胚胎干细胞特级胎牛血清，专为胚胎干细胞培养而筛选的zui高品质的特级胎牛血清。经40纳米过滤。内毒素含量<10EU/ml，血红蛋白含量<10mg/dl。
Insect Cell Screened Defined FBS：昆虫细胞特级胎牛血清，于SF-9等昆虫细胞培养而优选的zui高品质的特级胎牛血清。尤其适用于杆状病毒表达载体系统进行重组蛋白生产。经40纳米过滤。内毒素含量<10EU/ml，血红蛋白含量<10mg/dl。