N15和C13标记重组蛋白的制备

N15和C13标记重组蛋白的制备

随着科学技术的发展，蛋白质结构学和蛋白质组织代谢学开始飞速的发展，特别是近些年NMR（nuclear magnetic resonance）技术在蛋白结构分析领域逐渐成熟，使蛋白质的结构分析变得简单易行。 NMR分析蛋白结构的基本原理是利用核质谱仪发出一系列的电磁波，激发蛋白中的H、N、C原子，使H、N、C这些原子从基态转变成不稳定的激发态，当电磁波发射完毕后，激发态的原子会自动恢复到基态，多余的能量就释放出去，通过收集这些能量信息，做进一步的分析便能得到蛋白的原子结构，画出蛋白的三维结构图。 NMR技术虽然操作简单，但是需要组成蛋白的H、N、C原子具有共振性，H具有天然的共振性可以分析10KD以下的蛋白，常规蛋白中含有的N14和C12不具有共振性，需要采用他们的同位素来代替。N15和C13属于稳定同位素不具有放射性，是目前取代常规蛋白中N14和C12代替物，所以我们在做蛋白结构NMR分析过程中，zui为重要的方面还是在大量 N15和C13标记蛋白的获得。

蛋白质获得的方式有很多种，但是要获取大量的目标蛋白，仍然需要通过重组蛋白生物合成途径，一方面容易控制生产条件，另一方面目标蛋白的产量和质量能够得到保障。重组蛋白的生物合成可以选择原核表达系统、酵母表达系统、杆状病毒-昆虫细胞表达系统、哺乳动物细胞表达系统等，目标蛋白需要用N15和C13标记，这使得培养细菌和细胞的培养基中不能带入额外的C源和N源。出于对操作方便性、实用经济性、产量高低、技术难度等多方面考虑，重组蛋白的生物合成以原核表达系统和酵母表达系统为主。原核表达系统中培养大肠杆菌的培养基常用M9葡萄糖矿物培养基，酵母表达系统中培养毕赤酵母的培养基常用察氏(czapck)培养基，这两种培养基C源即用C13的单糖或二糖，N源即用含N15的氯化铵或硝酸钠等，培养条件简单，产生的标记蛋白易纯化。（简易步骤如图所示）