流式细胞术的基本理论

流式细胞术的基本理论

1. 工作原理 流式细胞仪主要由流动室及液流系统、激光器及光学系统、光电管及检测系统、计算机及分析系统四个部分组成，见图18-1。

待测细胞被制备成单细胞悬液，经特异性荧光染料染色后置于样品管中，在气体压力推动下被压入流动室，流动室内充满鞘液（不含细胞或微粒的缓冲液），在高压作用下从鞘液管喷出包裹细胞，使细胞排成单列形成细胞液柱，依次通过检测区。液柱与高度聚焦的激光束垂直相交，被荧光染料染色的细胞受到激光激发产生荧光信号和散射光信号，这些光信号通过波长选择的滤光片，由相应的光电管和电子检测器接收并转换成电信号，经放大器放大后送入计算机并进行分析显示和结果输出。

带有细胞分选功能的流式细胞仪对细胞的分选是由分选器来完成。待分选的细胞在形成液滴时被充以特定的电荷，并通过超高频的压电晶体产生高频振荡，使液柱断裂成均匀的液滴，带有电荷的液滴向下落入偏转板的高压静电场时，按照所带电荷发生偏转，落入的收集器内，完成分类收集的目的。

2. 光学原理　流式细胞仪的光学系统由激光器和若干组透镜、滤光片等光学元件及光学通路组成，细胞带有的特异荧光染色经激光器的激发，通过不同的光学元件将不同波长的荧光信号送入到相应的电子探测器。

流式细胞仪的激光器以氩离子激光器常见，光学元件主要是分色反射镜（DL）和滤光片（Filter），它们主要分为三类：长通滤片（long-pass filter，LP）、短通滤片（short-pass filter，SP）和带通滤片（band- pass filter，BP）。

（1） 分色反射镜（488DL、 550DL、 600DL、640DL）：用于选择被测荧光波长，只允许大于特定波长的光通过，而将小于特定波长的光反射到光电检测器。

（2） 长通滤片：只允许特定波长以上的光通过，特定波长以下的光不能通过。如LP620nm滤片，只允许620nm以上的光通过，而620nm以下的光被吸收或返回。

（3） 短通滤片：与长通滤片相反，允许特定波长以下的光通过，而特定波长以上的光被吸收或返回。

（4） 带通滤片（488BP、525BP、575BP、675BP）： 允许某一特定波长的光线通过，而其他波长的光全部被阻断。

例如，FITC染料发射出525nm的绿色荧光，PE染料发射出575nm的橙色荧光，分别选择550DL和525BP组成的滤片组和600DL和575BP滤片组，即可达到特异地接收FITC和PE荧光信号的目的。光电倍增管和硅光电二极管，可分别将侧向散射光和前向散射光以及525～675等不同的荧光信号收集检测。

3. 参数测量　流式细胞仪可同时进行多参数测量，信息主要来自特异性荧光信号及非荧光散射信号。

（1）散射光测量：细胞在通过测量区时由于受光照射会向空间360°立体角的所有方向散射光线，散射的信号与细胞的大小、形状、质膜和细胞内部的折射率有关，与收集散射光的方向也有关。在流式细胞术中一般采用0°前向散射光（forward scatter, FS）和90°侧向散射光（side scatter，SS）。前向散射光的强度与细胞大小有关，对于同一个细胞群体，散射光强的细胞大一些；而散射光弱的细胞小一些。侧向散射光对细胞膜、胞质、核膜的折射率更为敏感，对胞质内较大的颗粒也有反应，可获得有关细胞内部精细结构和颗粒性质及膜表面光滑程度的有关信息。图18-2是利用流式细胞仪前向散射光和侧向散射光测得的全血白细胞二维点图，由图中可见，利用FS和SS可将白细胞群中不同细胞群分开，得到很清楚的三群细胞。

（2）荧光测量：荧光信号主要包括两部分：①自发荧光，即不经荧光染色细胞内部的荧光分子经光照射后所发出的荧光。细胞成分中能够产生的自发荧光的分子（例核黄素、细胞色素等）的含量越高，自发荧光越强；培养细胞中死细胞/活细胞比例越高，自发荧光越强。②特征荧光，即由细胞经染色结合上的荧光染料受光照而发出的荧光。用流式细胞仪测定细胞的特征荧光时，自发荧光对所测定特征荧光是一种本底信号，应设定阴性对照样品加以去除，同时应尽可能地通过选用较亮的荧光染料染色细胞、选用适宜的激光和滤片光学系统、采用电子补偿电路等方法提高信号/噪声比，以减少自发荧光的干扰，这是在样品处理与测量中应特别注意的问题。

荧光补偿：对于双标记或三标记荧光染色的样品，在应用FCM测量时需要对荧光信号的光谱重叠部分进行校正，特别是在实际测量中当两波长比较接近，如FITC发射的525nm荧光和PE发射的575nm荧光会发生交叉干扰，而使被测信号失真，测量结果产生较大的误差，因此需采用荧光补偿方法来解决这种交叉重叠的问题。目前生产厂家都提供有荧光补偿的实用程序，用厂商的488nm激光激发的三种荧光染料（FITC、PE、PerCP），在测量中加以正确补偿即可比较容易达到正确测量荧光信号的目的。

4. 测量参数分析　流式细胞仪的数据显示方式包括单参数直方图（histogram）、二维点图（dot plot）、二维等高图（contour）、假三维图（pseudo 3D）等。

（1）单参数直方图：是流式细胞术使用zui多的一种分析方法，它主要用来分析细胞相对数与测量参数之间的关系（图18-3）。只能显示一个参数与细胞之间的关系是它的局限性。

（2）二维点图：二维点图能够显示两个独立参数与细胞相对数之间的关系。横坐标和纵坐标分别为与细胞有关的两个独立参数，平面上每一个点表示同时具有相应坐标值的细胞存在。但对细胞点密集的地方就难于显示它的精细结构（图18-4）。

（3）等高线图和密度图：可以同时表达检测参量和细胞频度，等高线图是将代表相同细胞数目的点依次连接起来形成密闭的曲线，越在里面的曲线代表的细胞数目越多（图18-5）；密度图则依据细胞分布的密度大小，细胞密度大的地方点的密度大，使数据的显示更直观。

（4）假三维图：利用计算机技术将原二维图中的隐坐标-细胞数同时显现，能多方位地观察“山峰”和“谷地”的结构和细节，更为直观，有助于对数据进行分析。

5. 使用流式细胞仪注意事项

（1）光电倍增管要求稳定的工作条件，暴露于较强的光线下以后，需要较长时间的“暗适应”以消除或降低部分暗电流本底才能工作；另外还要注意磁屏蔽。

（2）使用光源必须预热并注意冷却系统工作是否正常，光源不得在短时间内（一般1h左右）反复开关。

（3）液流系统必须随时保持液流畅通，避免气泡栓塞，所使用的鞘液使用前要经过过滤、消毒。

（4）注意根据测量对象的变换选用合适的滤片系统、放大器的类型等。

（5）每次测量都需要设立对照组。