质粒DNA的大量提取、纯化及棉花的遗传转化

质粒DNA的大量提取、纯化及棉花的遗传转化

实验试剂

1. STE [0.1 mol/L NaCI、10 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0), 1 mmol/LEDTA (pH 8.0)]

2. 溶液I [50 mmol/L蔗糖、25 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0), 10 mmol/L EDTA (pH8.0)]

3. 溶液II (0.4 mol/L NaOH和2%SDS等量混匀)

4. 溶液III (3 mol/L Kac, pH 4.8)

5. 异丙醇

6. 4 mol/L LiCI

7. RNase

8. *、酚-

9. 乙醇

实验设备

1. 摇床

2. 制冰机

3. 高速离心机

4. 水浴锅

5. 超净工作台

6. 玻璃毛细管

7. 微量注射器

实验材料

棉花，转化农杆菌菌株

实验步骤

1. 37℃, 250 rpm摇菌500 ml。

2. 5000 × g离心5 min以收集菌体，用50 ml STE洗涤菌体一次。

3. 加入溶液I 20 ml悬浮菌体。

4. 加溶液II40 ml，轻轻将离心管颠倒几次，置冰浴20 min。

5. 加预冷的溶液III30 ml，将离心管颠倒几次，置冰浴10 min以上。

6. 10000 × g离心15 mm，取上清液加入0.6倍体积的的异丙醇，充分混匀后室温放置10 min以上。

7. 10000 × g离心10 min，弃上清。待沉淀干燥后用350ul水溶解，加350 ul 4 mol/L LiCI，混匀后室温放置10 min以上。

8. 10000 × g离心5 min，取上清液加入RNase至终浓度为100 ug/ml，37℃保温2h。

9. 用*、酚-、各抽提一次。上清加0.1倍体积的3 mol/L NaAc (pH5.2)及2倍体积的无水乙醇。

10. 离心收集DNA沉淀，70%乙醇洗涤一次。干燥后溶于TE中备用。

11. 棉花的遗传转化:大量的质粒，用无菌水稀释成2 mg/ml的DNA溶液进行子房注射。注射在超净工作台上进行，注射针是玻璃毛细管，顶端直径约为0.1mm。将毛细管另一端紧紧套入10-20ul的微量注射器针头，吸取被注射的DNA样品6-12ul。注射时，将针头对准子房伸出的花丝部分进行。每个子房约注射0.2ulDNA。