动植物样品的采集及DNA样品的提取（上）

动植物样品的采集及DNA样品的提取（上）

1.动物样品的采集及处理方法 
       遗传学数据在野生动物和圈养动物的保护和管理中变得日益重要。在本文中，我们总结了一些能简便而有效地获得样品及数据的方法。 
       我们在采集样品之前，对将要进行的遗传学分析有所了解。然而，采集者并非都是研究者，当采集地与实验室有相当距离时，采集者常常要保存好样品直到有合适的接受者或存放地，这就要求采集者应具备一定的经验。 
       首先，所有样品均应以个体序号进行标注，并且应写上种名、性别、采样者姓名以及采集日期，越详尽越好，以便同一个体的不同类数据可以相互引用，另外，地理来源的标注也很重要，需要注明。对于野外捕获的动物，有条件者在地图上标明捕获地及其经纬度。对圈养动物的每个野外捕获种源都要有同样的记录和详尽的谱系图，因为谱系图可用于计算近交系数。 
       总之，背景资料越详细越好，即使不能得到这里所列的全部信息，也要尽可能详尽。 
 
 
1．1 样品的测量方法 
在一定数量的分类群中采用的标准测量方法可用于以下四个方面： 
（1）分类学上：一套理想的测量方法应能大致上重建机体每个主要硬件部分的形状和大小。 
（2）不对称性分析：机体各部分的起伏不对称，也许表明进化过程在一定程度上正在变得不稳定，这可能是环境压力或近交的结果。测量不对称时机体左右两部分均应考虑在内。 
（3）遗传变异：在科级水平上，如果对同一年龄的个体采用同样的测量方法，就有可能对所选特征中的遗传成分变异进行粗略的估计。虽然并非总是能做到这样，但能使遗传学家对所选特征（如生殖特征方面遗传变异的任何丢失）进行监视。 
（4）生理检测或记录：采用标准测量方法得到的记录，也许会有助于与用其他手段得到的数据起来分析。例如，如果有了形态的记录，或是特殊寄生物的感染记录，遗传学家就能因此寻找在不同群体中这些因素与变异水平的相关性。 
 
 
1．2 组织样品的采集和保存 
    下面详细给出针对不同研究目的的适当方法。当然，每个实验室都有各自习惯的组织处理方法，因此，本文仅给出快速保存的有关要求，但对每种组织的可用性都有所评述，以便在用途有冲突时，能对潜在数据的可能应用作出迅速判断。  
 
    使用肿瘤、毛发及样品，保存时应特别注意。使用细胞培养样品可减少对活体或新杀动物的依赖，如果培养物来源于肿瘤组织细胞，则可大量减少对同种动物组织的进一步需求。组织材料必须在数小时内送到有关实验室或用于其他的细胞培养。如果已经知道DNA 序列的一小部分，就可利用PCR 技术从很少一部分组织中扩增DNA，从而使极其的样品（如一根毛发或单个）具有更高的利用价值和更大的可信度。 
组织必须取自活体动物或死后1～2 分钟内的动物，并且要快速保存起来，除非出现下述情况：在野外条件或是匆忙安排的活体取样，因此没有时间同实验室。此时要有目的地扩大采集和储存量。如果已经详细知道样品的确切用途，则有时条件可以放宽。例如，对血液样品来说，有些酶是不要求立即冻存的。快速冻存时样品可放人液氮、干冰中或直接放入－70℃冰箱。冻存样品可在—70℃液氮、冰箱、干冰或－20℃冰箱中保存和运输。样品冻存及运输均以放入液氮中效果较好。非冻结冰箱是不能用的。 
 
1．2．l 用于染色体研究的软组织的处理 
    室温下将全部或部分样品浸入0．9％的生理盐水中，在数分钟内将样品送至实验室，zui迟也要在1～2 小时之内送到。 
    研究染色体能看到有丝分裂和减数分裂，从而了解有关染色体倒位等现象。染色体倒位会影响到受精和遗传重组，可能的同性个体应从染色体方面进行检查，但对哺乳动物来说，通常不需要研究同性别的染色体。 
 
 
1．2．2 用于成纤维细胞培养的组织的处理 
    通常来源于幼体动物的组织用于细胞培养较好。在一个个体中，癌组织和肺组织是的，但其他软组织也可以用。 
    细胞培养常用的是新鲜组织，但捕杀几天后的动物组织仍能用来培养。总之，样品越快到实验室，成功的可能性就越大。 
    如果取样时需切开活体动物的皮肤，则应当在无菌的条件下进行。对细胞培养来说，无  
菌条件下进行进一步的处理也是很有必要的，而在野外这是难以做到的。因此，一个不透风的封闭空间以及面具、手套是很有用的，至少操作人员应离开工作台面远一些。所有的台面、试剂瓶、手套、仪器等使用前要用70％的酒精消毒。所用的试剂应是新鲜的，如果对其无菌性有任何怀疑（如变浑浊或变颜色）就应倒掉。 
在无菌条件下将组织样品放入0％的酒精中，摇动1 分钟后，将样品转人收集液中，在室温下放置1～4 天。如需放置更长时间，则两天后须将组织样品转到运输液中，就可再于室温下存放几天。转移过程中无菌操作是很重要的，因为运输液中一般不使用防腐剂。 
    收集液和运输液一般由接受样品的实验室提供。成纤维细胞培养可生产出更多的材料而不必再从动物中取，达到事半功倍的效果。 
 
 
1．2．3 用于染色体研究的血样的采集 
    采血样须无菌操作。采血用的注射器、小瓶等应用肝素润湿。有些用品买来时就已经用肝素处理过。迅速将血样送往实验室（在低温条件下但不使其冻结）。如果条件不允许，可在无菌条件下，每 0．lml 血样加 5ml 的血样处理液，然后在室温下转送到实验室（实验室会有另一种准备好的处理液）。 
 
1．2．4 用于酶及其他蛋白质研究的软组织的处理 
    将软组织切成1cm 见方的小块，包好并迅速冻存。如将组织块浸泡在2％的苯甲醛中，在室温下放置，某些酶的活性可保持几个月（Nakanishi 等1969）。一些鱼类蛋白质可以用市场买来的材料进行分析，但这里的目的是区分种，而不是为了获得详尽的遗传数据。 
 
 
1．2．5 用于酶和蛋白质研究的血样的采集 
    试验所用的注射器、试管等应用肝素包被（是锂盐），或者是用低温保存的肝素润湿。如果可能的话，所有溶液配制等操作均应在5℃条件下快速完成。对于较大体积的样品（＞5ml），将红细胞、白细胞、血浆分开。首先在1000r／min 离心10 分钟，快速吸取血浆，迅速分装冻存。然后吸出漂浮在红细胞表面的一层白细胞带，再用5～10 倍体积的PBS 将红细胞洗两次后离心，zui后将片状沉淀物快速冻存。 
    白细胞层用ACK 溶解（0．15mol／dm３ 氯化铵、0．01mol／dm３ 碳酸氢钾、0．lmol／dm３ Na２ EDTA），直到变成澄清的红色（约 5 分钟）。在 500r／min 离心 5 分钟后，小心吸去 ACK 和红细胞碎片，剩下的白细胞会重新悬浮于 ACK 中。2 分钟后，细胞成团沉淀，此时再用 PBS 洗。如果沉淀物仍为红色，则将整个过程重复一次，而后将其冻存。白细胞（酶的来源）也可以通过将等分血样铺展于20％的Ficoll、4．5％Na２ EDTA中的方法，使其沉降（10～15 分钟），再用巴氏吸管从界面吸取白细胞，于1000r／min 离心10 分钟，而后冻存。用 Ficoll 分离的红细胞很难再复原。 
    有些蛋白质可以用其他方式保存的血样进行分析：①保存于5℃并在几小时内送到实验室的；②冻存的全血（未处理过）；③全血或经分离的血样稀释于3 倍体积的苯甲醛中，并保存于室温下。蛋白质电泳是用于研究种群内遗传多样性或分类学差异的方法。同其他脊椎动物相比，哺乳动物血样并非是很好的酶和蛋白质的来源，有时取软组织更好。 
 
1．2．6 用于核DNA 研究的软组织的保存 
    将组织切成1cm 见方的小块，包起来冻存。或将其放入几倍体积的80％乙醇（分析 
纯）中，于4℃下存放。两种方法中以前一种方法更好。 
 
 
1．2．7 用于核DNA 研究的血样的保存保存血样可用占血样体积0．01 倍的15％ K２EDTA 作为抗凝剂，并且能够加入0．05倍的蛋白酶K（0．1％，核酸级，Boehringer Mannheim 冰冻保存，用新解冻的），充分混合后迅速冻存。血与EDTA 混合液可在室温下放置几天，但DNA 的质量不会太好。 
DNA 技术可以分析几乎所有组织样品基因组的任何一部分，从而能够克服用蛋白质研 究变异及分类学时出现的有关问题。 
 
1．2．8 用于制备DNA 的毛发及样品的保存 
    虽然以前从干燥或用福尔马林固定的毛发及样品中提取过DNA，但zui可靠的保存方法是冻存（Impraim 等 1987；Thomas 等 1990）。必须注意的一点是，尽可能地减少其他来源的DNA 对样品的污染，特别是实验者的手，因为PCR 反应对微量DNA 是很敏感的。较好的做法是仪器经烘烤（180℃过夜）或火焰消毒，其他所用的每一件东西（手套、试管、工作台面）用一套新的、经γ射线消毒处理的商业化产品。样品也可以用来作常规的遗传分析，如不需要人工控制交配就可进行连锁研究（Li 等1988）。当然，样品还可用于人工授精，这在圈养动物的遗传管理上是很重要的。 
 
 
1．2．9 用于提取线粒体DNA 的软组织及血样的保存 
    将样品在4℃下保存，并尽快送到实验室。血样贮存于有葡萄糖柠檬酸包被的真空管中时，可以冻存几年（在液氮中），但解冻后只能在室温下保存几天时间。线粒体DNA 的分析对研究物种在地理分布上的变异及构建谱系尤其有用。 
 
1．2．10 用于提供RNA 的软组织的保存 
    RNA 会在极短的时间内被破坏，因此必须在动物死亡或活检后1～2 分钟内迅速将其切成1cm 的小块，并放人液氮中冻存。 
    RNA 可用于 DNA 文库的构建，它能为遗传学家提供探针，用于个体总DNA 中单个活性基因的分析。虽然来源于其他动物的探针也能用，但用同种的探针效果。 
 
 
2 动物组织DNA 样品的提取 
    目前提取高分子量的DNA 的方法已有很多，我们在这一部分中除了介绍常规的DNA提取方法外，还将着重讨论由微量样品（如毛发）和陈旧古老样品提取DNA 的一些新方法。 
 
2．1提取动物总DNA 的常规方法 
    从动物组织中提取DNA 的常规步骤如下： 
（1）取动物组织100mg 左右于样品管中，用干净的剪刀将组织块剪碎。 
（2）在样品管中加入如下试剂： 
500μl STE 溶液 
25 μl 蛋白酶 K（Proteinase K，10 mg／ml） 
75μl 10％ SDS 
（3）混匀后置56℃下消化2 小时以上（隔一定时间混匀一次）。 
（4）加人等体积的饱和酚溶液，轻轻颠倒混合5 分钟以上（用于rDNA 和RAPD 分析的样品需抽提24 小时）。 
（5）7 000r／min 离心5 分钟。 
（6）小心将上层清液移至另一干净的离心管中，加入等体积的*及，并重复步骤（4）和（5）的抽提过程。 
（7）以等体积的（内含1／25 体积的异戊醇）重复步骤（4）和（5）的抽提过程。 
（8）在上清液中加入 1／10 体积的 3mol／dm３NaAc 或 5mol／dm３NH４Ac、2 倍体积的冷无水乙醇或1 倍体积的异丙醇，以沉淀DNA。 
（9）置—70℃下沉淀2 小时或置—20℃下沉淀过夜。 
（10）7 000r／min 离心10 分钟，再以 70％冷乙醇洗涤DNA 沉淀一次。将沉淀置真空干燥器或37℃温箱中干燥。 
（11）以适量的TE 溶液（200～500μl）溶解DNA 样品。 
（12）以分光光度计测定DNA 的浓度（260nm），260／280nm 的光密度比值应在 1．8 以上，否则提示可能有蛋白质或*的污染。 
（13）以TE 溶液将DNA 样品稀释成所需的工作液的浓度。 
（14）取2μl 左右的样品进行电泳检测，以判断 DNA 是否有降解以及是否需要消除RNA。 
 
2．2 微量动物组织样品的总DNA 提取方法 
    从微量组织中提取DNA 的方法是1989 年由Singer-Sam（Walsh 等1991）发展起来的。此方法的基本原理是采用 BioRad Chelex 100（一种螯合剂）提取DNA。此方法简便、快速，提取后的DNA 样品可以直接作为PCR 的模板。具体的操作步骤如下： 
（1）取一小块冰冻的组织（少于1mg，可用经消毒的枪头钻取），或1～3 根带有毛根的毛发（需先经 90％、70％的乙醇和灭菌水依次清洗，并剪去毛干部分），或 1～5μl 血液，加入经过高温消毒的离心管中。离心管内事先加入 500μl 5％的Chelex 溶液。 
（2）将样品管在56℃下放置1 小时或更长时间，直至组织样品成粉末状（不同组织所需时间各不相同）。 
（3）在振荡器上振荡10～15 秒钟。 
（4）在 95～100℃下煮 15～40 分钟。 
（5）在振荡器上振荡10～15 秒钟。 
（6）将样品管在4℃下保存，进行PCR 反应之前再次离心，使Chelex 颗粒沉淀。取上清液（1～10μl）作为DNA 模板。  
 
2．3 陈旧、古老DNA 样品的提取方法 
    对于陈旧、古老DNA 的研究始于80 年代中期。1985 年，Paabo 采用克隆的手段从古埃及木乃伊中提取并测定了一段DNA 序列。然而，较为广泛地开展对古老DNA 的研究是在多酶链式聚合反应（PCR）发明以后才开始的（Mullis，Fallona 1987）。 
    经过一定时期的物理、化学作用（几十年至几百万年）的DNA 往往存在比较严重的降解，DNA 段常常仅有几百个bp 的长度，并且可能存在碱基的修饰和一些抑制PCR 反应的物质。因此，在从陈旧或古老样品中提取DNA 时，zui为关键的问题就是防止现代DNA 的污染。进行DNA 提取操作的所有器皿、器械和试剂均要进行灭菌处理，提取过程应在超净台中进行。此外，提取时应设阴性对照，以监测是否存在外源DNA 的污染。下面介绍的是一种较为简便的提取方法。 
（1）取样品少许（如哺乳动物的皮张可取 1cm × 1cm 见方的小块），用剪刀、手术刀等器械对样品表面进行处理，除去zui容易遭受外来污染的表层。对于骨骼、琥珀等坚硬的样品则需要用小钢钻等特殊器械从内部取得样品。 
（2）经过表面处理的样品用90％乙醇、70％乙醇和去离子水依次进行清洗。 
（3）在灭菌的 Eppendorf 管中加入 200μl 去离子水、10μl 蛋白酶K（10mg／ml）和 1／10 体积的（20μl）10％的β-巯琉基乙醇。处理过的样品放入上述溶液前要尽可能剪碎。 
（4）在56℃下消化48 小时。 
（5）样品管中加入等体积的5％～10％的Chelex100 溶液，在旋涡混合器上振荡5～10秒钟，然后在98℃下放置20～60 分钟。 
（6）振荡混合5～10 秒钟，并使之冷却至室温。 
（7）12 000r／min 离心 5～10 分钟。 
（8）小心取出上层清液，置另一干净的管中保存。