Human ABCG2 ELISA Kit操作说明书

Human ABCG2 ELISA Kit操作说明书

特别说明： 
*: [96T/48T]（打开包装后请及时检查所有物品是否齐全完整） 
#: 一周内使用可存于4℃，需长时间存放或多次使用建议存于-20℃. 
相关试剂在分装时会比标签上标明的体积稍多一些，请在使用时量取而非直接倒出！ 
 
检测原理: 
本试剂盒采用双抗体夹心ELISA法。用抗人ABCG2抗体包被于酶标板上，实验时样品或标准品
中的人ABCG2会与包被抗体结合，游离的成分被洗去。依次加入*化的抗人ABCG2抗体和
辣根过氧化物酶标记的亲和素。抗人ABCG2抗体与结合在包被抗体上的人ABCG2结合、*
与亲和素特异性结合而形成免疫复合物，游离的成分被洗去。加入显色底物(TMB)，TMB在辣根
过氧化物酶的催化下呈现蓝色，加终止液后变成黄色。用酶标仪在450nm波长处测OD值，ABCG2
浓度与OD450值之间呈正比，通过绘制标准曲线计算出样品中ABCG2的浓度。 
样品收集: 
1. 血清：全血样品于室温放置2小时或4℃一夜后于1000×g离心20分钟，取上清即可检测，收集
血液的试管应为一次性的无热原，无内毒素试管。 
2. 血浆：抗凝剂推荐使用EDTA-Na2，样品采集后30分钟内于1000×g离心15分钟，取上清即可
检测。避免使用溶血，高血脂样品。 
3. 组织匀浆：用预冷的PBS (0.01M, pH=7.4)冲洗组织，去除残留血液（匀浆中裂解的红细胞会
影响测量结果），称重后将*碎。将剪碎的组织与对应体积的PBS（一般按1:9的重量体
积比，比如1g的组织样品对应9mL的PBS，具体体积可根据实验需要适当调整，并做好记录。
推荐在PBS中加入蛋白酶抑制剂）加入玻璃匀浆器中，于冰上充分研磨。为了进一步裂解组
织细胞，可以对匀浆液进行超声破碎，或反复冻融。zui后将匀浆液于5000×g离心5~10分钟，
取上清检测。 
4. 细胞培养上清：取细胞培养上清于1000×g离心20分钟，除去杂质及细胞碎片。取上清检测。 
5. 其它生物样品：1000×g离心20分钟，取上清即可检测 
6. 样品应清澈透明，悬浮物应离心去除。 
7. 样品收集后若在1周内进行检测的可保存于4℃，若不能及时检测，请按一次使用量分装，冻
存于-20℃(1个月内检测)，或-80℃（6个月内检测），避免反复冻融。 
8. 如果您的样品中检测物浓度高于标准品zui高值，请根据实际情况，做适当倍数稀释（建议先
做预实验，以确定稀释倍数）。 
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试验所需自备物品: 
1. 酶标仪(450nm波长滤光片) 
2. 高精度移液器，EP管及一次性吸头：0.5-10μL, 2-20μL, 20-200μL, 200-1000μL 
3. 37℃恒温箱，双蒸水或去离子水 
4. 吸水纸 
 
检测前准备工作: 
1. 请提前20分钟从冰箱中取出试剂盒，平衡至室温。 
2. 将浓缩洗涤液用双蒸水稀释(1:25)。未用完的放回4℃。从冰箱中取出的浓缩洗涤液可能有结
晶，属于正常现象，可用40℃水浴微加热使结晶*溶解后再配制洗涤液（加热温度不要超
过50℃，使用时洗涤液应为室温）。当日使用。 
3. 标准品: 于10000×g离心1分钟，加入标准品&样品稀释液1.0mL至冻干标准品中，旋紧管盖，
静置10分钟，上下颠倒数次，待其充分溶解后，用移液器将其轻轻混匀（浓度为10ng/mL）。
然后根据需要进行倍比稀释（注：不要直接在反应孔中进行倍比稀释）。建议配制成以下浓
度：10、5、2.5、1.25、0.625、0.313、0.156、0ng/mL，标准品&样品稀释液直接作为空白
孔0ng/mL。如配制5ng/mL标准品：取0.5mL10ng/mL的上述标准品加入含有0.5mL标准品&
样品稀释液的EP管中，混匀即可，其余浓度依此类推。  
4. *化抗体工作液：实验前计算当次实验所需用量（以100μL/孔计），实际配制时应多配
制100-200μL。使用前15分钟，以*化抗体稀释液稀释浓缩*化抗体(1:100)成工作
浓度。当日使用。 
5. 酶结合物工作液：实验前计算当次实验所需用量（以100μL/孔计），实际配制时应多配制
100-200μL。使用前15分钟，以酶结合物稀释液稀释浓缩HRP酶结合物(1:100)成工作浓度。
当日使用。 
标准品稀释方法图例：（以500μL/管为例，也可根据实际用量来稀释，如200μL/管） 
 
 1 2 3 4 5 6 7 8 Tube 
 10 5 2.5 1.25 0.625 0.313 0.156 0 ng/mL 
 
洗涤方法: 
1. 自动洗板机：每孔加入洗涤液350μL，注入与吸出间隔60秒。 
2. 手工洗板：甩尽孔内液体，在洁净的吸水纸上拍干，每孔加洗涤液350μL，浸泡1-2分钟，吸
去（不可触及板壁）或甩掉酶标板内的液体，在厚的吸水纸上拍干。 
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操作步骤: 
实验开始前，各试剂均应平衡至室温；试剂或样品配制时，均需充分混匀，并尽量避免起泡。 
1. 加样：分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。空白孔加标准品&样品稀释液 100μL，余孔分
别加标准品或待测样品 100μL，注意不要有气泡，加样时将样品加于酶标板底部，尽量不触
及孔壁，轻轻晃动混匀。给酶标板覆膜，37℃孵育 90 分钟。为保证实验结果有效性，每次
实验请使用新的标准品溶液。 
2. 弃去液体，甩干，不用洗涤。每个孔中加入*化抗体工作液 100μL（在使用前 15 分钟
内配制），酶标板加上覆膜，37℃温育 1 小时。 
3. 弃去孔内液体，甩干，洗板 3 次，每次浸泡 1-2 分钟，大约 350μL/每孔，甩干并在吸水纸
上轻拍将孔内液体拍干。 
4. 每孔加酶结合物工作液（临用前 15 分钟内配制）100μL，加上覆膜，37℃温育 30 分钟。 
5. 弃去孔内液体，甩干，洗板 5 次，方法同步骤 3。 
6. 每孔加底物溶液(TMB)90μL，酶标板加上覆膜 37℃避光孵育 15 分钟左右（根据实际显色情 
况酌情缩短或延长，但不可超过 30 分钟。当标准孔出现明显梯度时，即可终止）。 
7. 每孔加终止液 50μL，终止反应，此时蓝色立转黄色。终止液的加入顺序应尽量与底物溶液
的加入顺序相同。 
8. 立即用酶标仪在 450nm 波长测量各孔的光密度（OD 值）。应提前打开酶标仪电源，预热仪
器，设置好检测程序。 
9. 实验完毕后将未用完的试剂按规定的保存温度放回冰箱保存。 
 
注意事项： 
1. 保存：试剂盒中各试剂请按说明书提示合理存放。在储存及温育过程中避免将试剂暴露在强
光中。所有试剂瓶盖须旋紧以防止蒸发和微生物的污染，否则可能会出现错误的结果。 
2. 酶标板：刚开启的酶标板孔中可能会有少许水样物质，此为正常现象，不会对实验结果造成
任何影响。暂时不用的板条应拆卸后放入备用铝箔袋，按推荐温度存放！ 
3. 加样：加样或加试剂时，*个孔与zui后一个孔的加样时间间隔如果太大，将会导致不同的
“预温育"时间，从而明显地影响到测量值的准确性及重复性。每次的加样时间控制在
10分钟内。推荐设置复孔。 
4. 温育：为防止样品蒸发，实验时必须给酶标板覆膜；洗板后应尽快进行下步操作，避免酶标
板处于干燥状态；严格遵守给定的温育时间和温度。 
5. 洗涤：洗涤过程中反应孔中残留的洗涤液应在吸水纸上拍干，勿将滤纸直接放入反应孔中吸
水。在读数前要注意清除底部残留的液体和手指印，以免影响酶标仪读数。 
6. 试剂配制：Concentrated Biotinylated Detection Ab及Concentrated HRP Conjugate体积较
小，运输过程会使液体沾到管壁或瓶盖，因此使用*0转/分离心1min，以使附着管壁或瓶
盖的液体沉积到管底。取用前，请用移液器小心吹打4-5次使溶液混匀。标准品、*化抗
体工作液、酶结合物工作液请根据所需用量配制，并使用相应的稀释液配制，不能混淆。请
配制标准品及工作液，尽量不要微量配制（如吸取Concentrated Biotinylated Detection 
Ab时，一次不要小于10μL），以避免由于不准确稀释而造成浓度误差；请勿重复使用已稀释
过的标准品、*化抗体工作液、酶结合物工作液。若需要分次使用标准品应按照每一次
用量分装，将其放在-20～-80℃贮存。避免反复冻融。 
7. 显色时间的控制：加入底物后请定时观察反应孔的颜色变化（比如每隔5分钟），如梯度已很
明显，请提前加入终止液终止反应，避免颜色过深影响酶标仪读数。 
8. 底物：底物请避光保存，在储存和温育时避免强光直接照射。 
9. 混匀：充分轻微混匀对反应结果尤为重要，使用微量振荡器(使用zui低频率)，如无微量
振荡器，可在反应前手工轻轻敲击酶标板框混匀。 
10. 安全：试验中请穿着实验服并带乳胶手套做好防护工作。特别是检测血液或者其他体液样品
时，请按国家生物试验室安全防护条例执行。 
11. 不同批号的试剂盒组份不能混用（洗涤液和反应终止液除外） 
12. 试验中所用的EP管和吸头均为一次性使用，严禁混用，否则将影响试验结果！ 
结果判断: 
1. 每个标准品的OD值减去空白孔的OD值后作图，如设置复孔，则应取其平均值计算。以标准
品的浓度为横坐标，OD值为纵坐标，绘出标准曲线。亦可以OD值为横坐标，标准品的浓度
为纵坐标，绘出标准曲线。 
2. 推荐使用专业的曲线制作软件，如curve expert 1.3或1.4，在软件界面既可根据样品OD值，
由标准曲线查出相应的浓度，乘以稀释倍数；亦可将样品的OD值代入标准曲线的拟合方程
式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。 
3. 若样品OD值高于标准曲线上限，应适当稀释后重测，计算浓度时应乘以稀释倍数。 
 
灵敏度、检测范围、特异性和重复性: 
●灵敏度：zui小可测 0.094ng/mL。 
●检测范围：0.156–10ng/mL。 
● 特异性：可检测重组或天然的人 ABCG2，且与其它相关蛋白无交叉反应。 
● 重复性：板内，板间变异系数均<10%。 
 
操作概要 
1. 在各孔中加入标准品或样品各 100μL， 37℃孵育 90 分钟 
2. 倒去孔内液体，加入 100μL *化抗体工作液，37℃孵育 60 分钟 
3. 洗涤 3 次 
4. 加入 100μL 酶结合物工作液， 37℃孵育 30 分钟 
5. 洗涤 5 次 
6. 加入 90μL 底物溶液， 37℃孵育 15 分钟左右 
7. 加入 50μL 终止液，立即在 450nm 波长处测量 OD 值 
8. 结果计算