原生细胞的合成之经验分享

　　近年来，合成生物学的研究如火如荼地开展，其目的在于构建人工分子生物系统并执行定制的功能。
 

　　来自湖南大学的研究团队使用DNA分子反应网络封装在原生细胞中，以此构建了一种可以持续处理生物环境中波动生物信息的分子CPU(mCPU)，该研究成果发表于国际期刊Science Advances(IF=14.96)。原生细胞(protocell)的合成是该领域的一大挑战，下文为此研究团队中的王老师分享的一些相关经验。
 

　　1合成原理
 

　　原生细胞的特点是含有微米级大小的空腔和外部的双层磷脂膜。本论文采用反相微乳液方法制备人工的原生细胞，其特点是几乎可以封装任何物质，包括蛋白，核酸和微纳颗粒，并可以此定制用户定义的分子生物系统。
 

　　该方法首先将小体积的水溶液加入到大体积(至少10倍)的磷脂油相中，制成大量油包水的乳液，即单层的微米级腔室。然后将该乳液滴入到含有单层磷脂的水相中，即可获得双层磷脂的原生细胞。其中，封装的物质均溶解在小体积的水溶液中。
 

　　2合成步骤
 

　　准备油相
 

　　首先将储备溶液(溶解在10 μL CHCl3 中的50 mg/mL 磷脂溶液POPC)completely干燥。然后加入 1 mL 矿物油以溶解脂质膜，如 1.5 mL Eppendorf 管A，通过在 85°C 下孵育直到不再可见未溶解的 POPC。
 

　　准备水相
 

　　将所需的 DNA 链溶解在含有 5 mM Mg2+的 280 mM 蔗糖中，作为B管中的内部水相。C管是500μL含有单层磷脂的外部水相，由含有 5 mM Mg2+的DPBS 或280 mM葡萄糖，并在水相顶部加入200 μL POPC溶液。
 

　　制备乳液
 

　　将 20 μL 内溶液移液到 400 μL 油包脂质中，然后在水浴中超声处理 30 至 60 分钟以形成油包水乳液。
 

　　制备原生细胞
 

　　将乳液在室温下平衡 2 分钟并覆盖在管 C 的界面溶液上，然后在离心机中静态孵育 5 分钟。通过以 5000g 离心 5 分钟，获得底部的原生细胞，并在 4 °C 下储存。
 

　　3注意事项
 

　　重点难点1
 

　　高浓度的磷脂溶液需要completely干燥，最好在小容量的玻璃瓶中旋蒸，使之铺成一层的白色薄膜。否则后期很难thorough溶解，会形成大量团絮状的油相杂质。为此，后续的矿物油溶解和乳液形成过程中必要时可以超声。
 

　　重点难点2
 

　　从乳液到原生细胞的过程中，很多人无法通过离心获得沉淀产物。因为内部水相和外部水相没有形成密度差，本文采用的是280 mM蔗糖溶液作为外部水相，280 mM 葡萄糖溶液或DPBS作为内部水相。值得一提的是，在两者形成密度差的同时，需要保持渗透压相同以防止原生细胞破裂。
 

　　经过本文实验，280 mM蔗糖溶液与DPBS渗透压相同，均等同于生理条件下的渗透压285-305 mOsm/kg，因此该原生细胞可以在生理条件下与自然细胞相互作用。
 

　　管B的乳液加入到管C的外部水相中需要一段时间的静态平衡，使得单层磷脂的乳液充分接触单层油水界面。
 

　　以上为王老师原生细胞合成的经验分享，希望对大家有所帮助。同时也欢迎更多老师参与文献奖励活动，分享您的科研干货和心得体会！