原代细胞的培养方法及注意事项

原代培养的基本过程包括取材、 培养材料的制备、 接种及培养等步骤，原代培养的方法很多，基本和常用的是组织块培养法和分离细胞法。

1)用培养液湿润所取组织材料，并用锋利的眼科剪将附在其上的脂肪和结缔组织去除干净。再用平衡液 (PBS )或 Hanks 液漂洗; 用锋利的眼科弯剪将组织块剪成小块; 再用 PBS或 Hanks 液漂洗多次，直至液体不浑浊、无油滴、清亮为止。

2)用湿润的吸管吸取切碎的组织块，轻轻吹到培养瓶皿中，并将其按一定间距均匀放在培养瓶底壁上，量不要过多，要将组织块切面贴在培养瓶底壁上。

3)将培养瓶翻转，使瓶底朝上，在种植了组织块一侧的对侧面加足培养液，勿使组织块与培养液接触，塞紧瓶塞。

4)将种植了组织块的一侧朝上，静置于 37℃培养箱中;待组织块贴壁 1h 到 3h 后翻瓶，使贴壁的组织块浸没与培养液中，静置。

5)每隔 2 到 3 天更换一次培养液，或者根据培养瓶种颜色的变化确定换液时间。

1)刚接种后，组织块粘附不牢固，观察和转移过程中动作要轻，以防引起液体振荡，使组织块漂起。

2)培养初期，要注意观察有无细菌、霉菌污染。

3)原代培养要及时观察，记录。

4)过3-5天，需要换液以除去漂浮组织块和残留的血细胞，保证原代细胞正常生长。

1)首先用细胞分散法收获细胞，随时吸取少量消化液在镜下观察，并根据组织是否分散成细胞团或单个细胞，采取终止消化措施。用筛网滤掉未消化的组织块。

2)低速离心细胞悬液，弃掉上清液，加入含血清的培养液，轻轻吹打制成细胞悬液，计数并用培养液调整细胞密度。

3)根据培养的细胞类型和实验要求，用吸管吸取一定量的细胞悬液，加到培养瓶中。对于需要特殊底物的细胞，要先将底物涂一层于培养瓶皿底壁，然后接种细胞。

4)将培养瓶放入 37℃恒温箱中培养。

5)每隔 2 到 3 天更换培养液一次或根据培养液颜色的变化确定换液时间。

1)原代培养的分离细胞在初次接触体外环境时，虽然被分散成单个细胞，但它们之间的互相影响还是存在的， 而且这种影响对细胞能否存活是非常重要的。在这些细胞之间能产生一些促生长的活性物质， 使细胞彼此互相促进存活和生长。如果接种的细胞密度过低， 细胞之间的促生长作用很小， 虽然营养物质很充足， 也很难使细胞适应从体内的组织环境到被分散后进入独立生存环境的变化过程。 如果接种的细胞密度过大，会导致营养物质供应不足， 代谢废物积累较快需要经常换液和传代。

2)原代培养时初始培养在组织分散和分离细胞时细胞可能会受到严重的损伤。适当增大原代培养接种的细胞密度， 给培养的细胞提供更多的类似于在体内时细胞之间的相互作用， 会极大提高原代培养的细胞在体外存活率。待细胞适应体外环境后进行传代培养时再以较低的密度接种和培养。

3)由于细胞之间的相互的内在联系被打破，分离细胞在体外培养时经历的生存环境改变很大，在体外存活和生长的难度相应增加。 对于贴壁依赖性细胞来说，尽快使接种的细胞贴壁，是决定培养能否成功的关键。可以在接种后先将培养瓶置培养箱内培养 3h 到 5h，由于细胞悬液中带有少量培养液， 细胞即可以维持存活， 又可以很快接触到培养瓶底壁， 是细胞迅速黏附于底物，待细胞贴壁后，再补足培养液继续培养。

1)制备细胞悬浊液，计数并用培养液调整细胞密度。

2)在培养皿中加入足够的培养液。

3)将欲接种的细胞接种到培养器皿中。

4)在培养皿内放入一个有聚四氟乙烯包被的磁棒。将培养皿封口，送入恒温箱内。在磁力搅拌器上边搅拌边培养。若接种培养瓶或试管中，封口后可将培养器皿固定在恒温摇床上，边摇动边培养，无需放置磁棒。有些细胞也可以不用磁棒或磁力搅拌器，也不必使用恒温摇床，接种于预先用硅脂包被的培养器皿内直接在培养箱中静置培养即可。

5)培养液略呈黄色换液。吸出部分旧培养液，加入新鲜培养液即可。

1)进行悬浮细胞培养时必须保持细胞的悬浮状态。可以通过增加培养液的黏度来帮助细胞呈悬浮状态，如给培养液中加入低浓度的透明质酸复合物。在有搅拌装置的培养器皿内加入培养液是，以 5ml 为限度，否则搅拌时会产生气泡对细胞造成伤害。使用这种方式需注意勿使搅拌速度过快， 否则即可使培养液溢出又容易造成污染。 如果培养液的量在 5ml 以下，可以采用旋转瓶培养。给悬浮培养的细胞换液时要注意不要吸出细胞。

2)能够进行悬浮培养的细胞，其生命力一般都比较旺盛，体外分裂增殖的速度较快，营养成分消耗大，换液时间隔一般较短。

1）在原代培养的 1 天到 2 天内，要特别注意观察是否有细菌、真菌的污染，一旦发现，要及时清除，防止造成其它细胞的交叉感染；

2）随着培养的进程，培养液中的营养物质被逐渐的消耗，营养成分越来越少，细胞代谢产物越来越多，有细胞呼吸过程中释放出来的 CO 2 及其它产物如乳酸、丙酮酸等也逐渐增加。随着酸性物质的增加，培养液中的 pH值越来越低，培养液的颜色也越来越黄。因此，在细胞培养的过程中，要注意培养液颜色的变化，并根据培养液的颜色来决定换液时间。正常情况下，培养液呈桃红色;当培养液呈橙黄色时，细胞一般生长情况良好;呈淡黄色时，可能培养时间较长，营养不足，死亡细胞较多;呈紫红色时， 可能是细胞生长状态不好或已经死亡。所以， 应在培养液略黄时吸出部分旧培养液， 然后补加同等数量的新鲜培养液。换液过程中，不要吸出细胞，不要使培养液溢出培养瓶，避免各种微生物的污染。换液时，应将培养液事先预温至 37℃。

一般培养一天，组织细胞即可在培养瓶皿底壁黏附并贴壁生长。 2 天到 3 天后，细胞恢复增殖活动。随着培养时间的延长，细胞数量逐渐增多， 消耗的营养物越来越多， 需要换液的时间越来越短，当细胞逐渐长满培养瓶壁并形成一单层细胞时，细胞之间相互发生接触和联系，逐渐产生接触抑制作用，培养物生长速度减慢。 当培养物最后形成一层完整的细胞单层时，生长几乎停止。在细胞高达 80%融合时就需要进行传代了。

1)原代培养材料的选择，尽量选取繁殖能力较强的组织，如胚胎、幼小的生物体或者肿瘤组织等。

2)要注意无菌操作。其操作要求应高于外科手术

3)整个取材操作要迅速，尤其孕鼠浸泡乙醇时间1min左右，不能过长，以确保胚胎细胞活性。

4)运用消化法时Pancreatic enzymes温度应低于37℃，浓度只需平时消化细胞浓度的一半。因为此过程不像消化培养细胞时的1~10min，而是至少20min，先消化下来的细胞在此Pancreatic enzymes消化液中继续消化了10min以上。所以Pancreatic enzymes不能作用过强，否则这些细胞易被损伤而不易生存。

5)如使用组织块法，则应待组织块略干燥，能黏附于瓶壁时再使之与培养液接触，匆使组织块漂浮起来。如果组织块没有黏壁，则细胞不易生长，即使生长也因没有贴在瓶壁上，从而因不能观察到而无法收集到生长的细胞。

6)原代培养操作时，也可以使用未添加血清的DMEM或PBS洗涤子宫、胚胎或组织块等。

7)本实验也可以使用新生乳鼠做培养材料。此时要将乳鼠浸入75%乙醇2~3min使皮肤充分消毒，由于乳鼠原代培养污染概率更高，故应小心操作，避免污染细菌。乳鼠原代培养细胞的存活率不及胚胎细胞培养的成功率。